Среда, 23.07.2025, 19:48
Приветствую Вас Гость | RSS
Мой сайт
Меню сайта
Мини-чат
Наш опрос
Оцените мой сайт
Всего ответов: 1
Статистика

Онлайн всего: 2
Гостей: 2
Пользователей: 0
Форма входа
Поиск
Календарь
«  Март 2014  »
Пн Вт Ср Чт Пт Сб Вс
     12
3456789
10111213141516
17181920212223
24252627282930
31
Архив записей
Друзья сайта
  • Официальный блог
  • Сообщество uCoz
  • FAQ по системе
  • Инструкции для uCoz
  • Главная » 2014 » Март » 29 » Выделение, физико-химические характеристики и им
    03:55
     

    Выделение, физико-химические характеристики и им

    Автореферат диссертации на тему "Выделение, физико-химические характеристики и иммунохимические свойства эмбрионального альфа-2-глобулина"

    ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

    На правах рукописи

    БУЛГАКОВ Александр Александрович

    ВЫДЕЛЕНИЕ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ИММУНОХИМИЧЕСХИЕ СВОЙСТВА ЭМБРИОНАЛЬНОГО ПРЕАЛЬБУМИНА-1 И ЭМБРИОНАЛЬНОГО АЛЬФА-2-ГЛОБУЛИНА

    02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

    АВТОРЕФЕРАТ

    диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

    Владивосток 1992

    Работа выполнена в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической - химии Дальневосточного отделения РАН.

    Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

    Ведущее предприятие:

    доктор химических наук |а.Ф. Павленко]

    член-корреспсмчант РАН Ю.С.Оводов

    доктор химических наук, профессор Г.С.Катруха

    кандидат химически... наук Г.М.Фролова .

    Институт органической химии им.Н.Д.Зелинского РАН

    Защита состоится "-<> " ^^Ч 1992 г. в часов на

    заседании специализированного совета Д 003.93.01 по защите диссертаций в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022 г.Владивосток, проспект Столетия 159, ТИБ0Х.

    С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДВО РАН: г.Владивосток, проспект Стоетия Владивостоку, 159, ДВГИ.

    Автореферат разослан "/^уу 1992 г.

    Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук, ст.н.с. Г.И.Прокопенко

    Актуальнсстьпроблемы. В настоящее время ^известно, что ачественная трансформация клеток сопровождается изменением структур клеточной поверхности и молекулярного профиля антигенов, способных индуцировать специфический клеточный иммунный ответ хозяина и ксеногенных животных. Эти антигены, являясь биохимическими маркерами опухолевого роста получили название антигенов, ассоциированных с опухолями (ААО). К одной из наиболее универсальных для опухолевого роста групп ААО относятся онкофетальные антигены (ОФА).Предполагается, что ОФА тесно связаны с факторами регуляции молекулярных механизмов эмбрионального и злокачественного роста. В настоящий момент ОФА нашли широкое применение в практической онкологии для мониторинга злокачественных новообразований, дифференциальной диагностики и иммунолокализации опухолей. Изучение строения,иммунохимических и Физико-химических свойств ОФА дает возможность полнее понять молекулярные механизмы малигниэации и существенно улучшить иммунодиагностику и иммунотерапию ОФХ-синтезирующих опухолей. Чрезвычайный интерес представляет определение строения углеводных цепей OA, изучение взаимосвязи антигенной активности с конформацией белкового кора, определение природы и . локализации антигенных детерминант.

    К числу менее известных и слабо исследованных ОФА относятся эмбриональный О^-глобулин (ЭО^Г) и эмбриональный преальбумин-1 (ЭПА-1), открытке ранее Татариновым й.С. и Калашниковым В.В.

    Ц§55_работы. Целью настоящего исследования явилось:

    1. Поиск дешевого, доступного сырьевого источника для выделения иммунохимически гомогенных ЭПА-1 и эа2Г.

    2. Иммунохимическая идентификация выделенных . антигенов. Физико-химическое изучение их свойств.

    3. Разработка высокочувствительных методов определения антигенной активности.

    4. Исследование пространственной структуры ЭПА-1 и Э0^1" "л влияния различных факторов на ее стабильность.

    5. Исследование роли углеводного и белкового компонентов в Формировании антигенпах детерминант.

    6. Подтверждение специфичности разработанных тест-систем по

    определению уровня ЭПА-1 и ЭС^Г в биологических жидкостях.

    Данная работа является частью исследования маркеров опухолей, проводимого в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

    1. Предложено использовать отходы переработки абортивной крови в качестве нового доступного источника ЭС^Г и двух иммунохимических изоформ ЭПА-1: гликозилированной формы (ЭПА-1Г) и негликозилированной формы (ЭПА-1НГ), представляющей собой низкомолекулярный белок. Разработаны способы получения высокоочищенных Э<Х,г, ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ. Впервые показано, что в процессе беременности в кровь секретируются обе Формы ЭПА-1: ЭПА-1Г И ЭПА-1НГ.

    На основании сравнительного иммунохимического изучения ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ, а такхе антисывороток против них установлено, что гликозилирование белковой части молекулы не приводит, к появлению новых антигенных детерминант. Впервые показано, что углеводные цепи ЭПА-1Г построены по общему принципу, характерному для И-гликанов.

    Исследование пространственной структуры ЭПА-1НГ показало, что данный антиген относится к ^-структурированным белкам. Отмечена высокая обратимость конформационных изменений, обусловливающая стабильность нативной конформэции ЭПА-1НГ.

    . Доказана топографическая природа антигенных детерминант.

    В целях иммунодиагностики злокачественных новообразований разработаны высокочувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения ЭПА-1НГ и -^Г в биологических жидкостях.

    Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее результатам получены три авторских свидетельства.

    Апробация_работы. Результаты работы представлены и доложены на следующих конференциях: УПВсесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" (Тбилиси, 1S87), XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии ( (Ташкент, 1988), XVIII Международной конференции "Onoodevelopmental Proteins and Clinical Application"

    (Москва, 1990).

    Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах, содержит 38 рисунков, 14 таблиц и 190 литературных ссылок.

    СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выделение_ц_очистка_ЭПА;1Г_и_ЭПА;1НГ

    С целью поиска дешевого и доступного источника ЭПА-1 были исследованы 42 фракции, полученные в процесса переработки ретроплацентарной и абортивной крови на предприятии по производству бактериальных препаратов при Хабаровском научно-исслодовательском институте микробиологии и эпидемиологии Министерства здравоохранения РСФСР. Иммунсдиффуэионноо исследование показало, что только две фракции обладают активностью ЭПА-1. В концентрации 1-2 мкг/мл ЭПА-1 содержится в "осадке А0" и "осадке являющихся отходами промышленной

    переработки абортизной крови.

    Схема, предложенная для выделения и очистки ЭПА-1Г из абортивной крови, приведена на рис.1.

    Экстракт 'осадка А0" *

    Хроматография, рехронато-графия на ДЭАЭ-целлюлозе

    Гельфильтрац^я на сефадексе в-ЮО

    Хроматография на 9АЕ-сефадексе

    Гельфильтрация на биогеле Р-30 ЭПА-1Г

    Рис.1. Схема выделения ЭПА-1Г из "осадка Ао" абортивной крови.

    Экстракт "осадка Ао" представляет сложную смесь белков сыворотки крови, тканевых антигенов. Сходство некоторых из них по Физико-химическим свойствам (молекулярная масса, изоэлектрическая ,точка) с ЭПА-1Г затрудняло' выполнение поставленной задачи. При разработке схемы выделения ЭПА-1 мы учитывали, что сульфатные группы и остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот придают

    молекуле ЭПА-1 кислый характер

    ЗПА-1НГ выделяли из "осадка А^", также являющегося отходом

    переработки абортивной крови. В экстракте "осадка А^" по данным

    предварительного ипм/нохимического тестирования содержится

    антиген, иммунохимически идентичный стандартному ЭПА-1 и ЭПА-1Г.,-

    выделенному из "осадка Ао".

    Однако физико-химическое исследование этого компонента

    показало, что он существенно отличается по своей природе и ряду

    свойств от стандартного ЭПА-1 и ЭПА-1Г. Учитывая это

    обстоятельство, а также то, что "осадок Акачественно и

    количественно отличается от "осадка Ао" по спектру образующих его-

    белков и специфических антигенов, мы разработали способ выделения

    ЭПА-1НГ, который приводится на рис. 2.

    Экстракт '^осадка А1"

    Хроматограф.-я, рехроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

    Хроматография на КМ-целлвлоз« .

    Гельфчльтрация на сефадексе в-50

    Хроматография замещения амфолинами на ДЭАЭ -сефацеле

    Негативная аффинная хроматография

    Высокоэффективная обращенная хроматография на С^-силасорбе

    ЭПА-1НГ

    Рис. 2. Схема выделения ЭПА-1НГ из "осадка Д^" абортивной крови.

    В таблице 1 приведены основные физико-химические свойства обои

    препаратов ЭПА-1.

    Как видно из таблицы 1, ЭПА 1Г является также, как и ЭПА-1

    из сыворотки плодов человека, сулефатированным сиалогликопро-теином. Он отличается заметной молекулярно-весовой гетерогенностью.

    ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ имеют близкий аминокислотный состав (табл. 2).

    Таблица 1

    Физико-химические свойства ЭПА-1

    Свойства ЭПА-1Г ЭПА-1НГ ЭПА-1 из сыворотки

    плодов человека

    Молекулярная масса, (М, кДа) по данным:

    ДСН-электрофореза* 11±3

    гельфильтрации 32±0.5

    Электрофоретичес-кая подвихность^в

    агаре (рн 8.6) 1.15

    Изоэлектрическая

    точка 3.5

    Н-Концевая аминокислота

    Белок (вес %) 78.5

    Углеводы (вес, X) 20.6

    Из них: Fue 3.0

    Man - 3.2

    Gal .7.8

    GloNAo 5.4

    GalNAo 1.2

    NANA 1.0

    Сульфат 2.0

    6.5±0.5 41+3.2 , 23+0.8

    2 H0.5 32±0.5

    1.20 1.17

    Gly и.о.

    98.1 76.9

    0 ' следы

    • 0 2.0

    электрофорез в 7.5-30Х ПААГ в присутствии ДСН.

    относительно человеческого сывороточного альбумина.

    Иммунохнкическую гомогенность ЭПА-1Г и*ЭПА-1НГ подтверждали рядом методов.

    С помощью двойной радиальной иммунодиффузии и иммуноэлек-трофореза показано, что полученное ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ не дают перекрестных реакций с нормальной белками человеческой плазмы, другими антигенами амниотической жидкости, а также с такими онкофетальными антигенами, как раково-эмбриональный антиген(РЭА), <Х-фетопротеин (АФП), трофобласт-специфический Р^глобулин (ТБГ). Б иммуноэлектрофорезе со стандартной моноспецифической

    Таблица 2.

    Аминокислотный состав ЭПА-1Г и ЗПА-1НГ Аминокислоты ЭПА-1Г ЗПА-1НГ АМИНОКИОЛОТЫ ЭПА-1Г ЭПА-1НГ

    Азх 6 8 Ме1 О О

    Т)1г 5 3 Не 12

    Бег 5 3 1.еи 3 3

    й1х 7 8 Туг 4 2**

    Рго 6 10 РЬе 2 1

    01у 7 5' Тгр 1 5**

    А1а 5 5 Ьуу 3 2

    1/2 Суэ 13 Н1г 11

    Уа1 4 5 Агб ' 1 1

    * Содержание аминокислот приведено в остатках на молекулу.

    _ ** Содержание триптофана определено спектрофотометрически.

    антисывороткой к ЭПА-1 обе формы ( ЭПА-1Г и ЭПА-1КГ) образуют по одной дуге преципитации в области преальбуминов. Кроме того, к обоим препаратам были получены моноспецифические

    поликлональные гипериммунные антисыворотки .которые не потребовали дополнительного истощения донорской плазмой, что свидетельствует о высокой степени чистоты ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ.

    Иммунохимическое сравнение ЭПА-1Г и ЭПА-1НГ со стэндартной тест-системой на ЭПА-1 показывает полную иммунохимическую идентичность полученных антигенов и антисывороток к ним стандартному ЭПА-1 и антисыворотке к нему соответственно.

    СтЕоение_ГЛ§водного_компонента_ЭПА-1Г

    Показано, что имеются существенные различия в строении углеводных цепей и, характере гликозилирсвания гликопротеинов нормальных и неопластических клеток.

    Нам не удалось получить антител.., направленные к углеводным цепям ЭПА-1Г, о чем свидетельствует полная иммунохимическая идентичность гликозилированной и негликозилированной Формы антигена. В связи с этим можно предположить, что углеводные цепи 'антигена построены по общему принципу, характерному для

    Н-гликанов, и не участвуют в формировании детерминантных групп ЭПА-1Г.

    Данный вывод не является строгим доказательством, так как вопрос иммуногенности углеводных цепей ЭПА-1Г остается открытым. Несомненный интерес в этой связи представляет изучение строения углеводного компонента ЭПА-1Г.

    Для определения характера гликозидных связей между моносахаридными остатками углеводных цепей ЭПА-1Г подвергали исчерпывающему метилированию по методу Хакомори. Количественное соотношение полученных метиловых эфиров представлено в таблице 3. Для выяснения места присоединения остатков нейраминовой • кислоты было проведено дасиалирование ЭПА-1 нейраминидазой из Vibrio cholerae с последующим метилированием. При этом наблюдается резкое уменьшение содержания 2,4,6-три-0-метил галактозы, что свидетельствует о присоединении остатков нейраминовой кислоты по С-3 остатков галактозы.

    Таблица 3.

    Соотношение метилированных производных моносахаридов гидролизата ЭПА-1Г

    Моносахарид ЭПА-1Г

    1.4 1.8 2.65 1.7 1.2 0.8 0.5 0.6 1.0 0.1 1.6 0.2'

    * Рассчитано относительно 2,4-ди-0-метилманнозы.

    2,3,4,6-Me4Gal 2

    2,3,4-MegFuc 1

    2,4,6-MegGal 3

    2,3,4-HegGal 6

    3,4,6-МвдНап 4

    2,3,6-MegMan 5

    2,4-Me2Gal f 9

    3,6-Me2Man 7

    2,4-Me2Man &

    3,4-Me2Man 10

    3,6-tfe2GlcN(Me)Ac 11

    6-Me-GlcN(Me)Ac 12

    Место локализации сульфатных групп определяли метилированием предварительно десульфатированного ЭПА-1. В продуктах гидролиза полностью отсутствует 2,4,6-три-0-метил-гллактоза, что можно объяснить наличием сульфатной группы при С-3 остатков галактозы и десиалированием в процессе сольволитического десульфатирования.

    На основании анализа литературных данных, касающихся вопроса биосинтеза углеводных цепей, а такие результатов метилирования ЭПА-1Г, его десиалированного и десульфатированного производных, нами предложена ориентировочная структура углеводных цепей ЭПА-1Г содержащих Н-гликозидные связи (рис. 3).

    ±Гис(Х1

    Са1|Э1-401сКАсР1-2Напа1.

    ±Н503 /

    -ЗСа1Р1-401сНАоР1-2МапС11 /

    ±ИаМа 0а1Р1-401сйАсРГ . ±РисС11 3

    0а1Р1-401сНАсР1-2Мап<11.

    ^НапР1-

    3 НапР1—Е?

    ±Н503-ЗСа1Р1-401сНАсР1-2Иапа1-^ II

    Рис. 3. Ориентировочная структура три- (I) и диантенных (II) углеводных цепей ЭПА-1Г.

    Результаты метилирования подтверждают, что углеводная часть' ЭПА-1 Г построена по общему принципу, характерному для Н-г.'чканов и, вероятно, выполняет роль фактора, стабилизирующего конформацию молекулы антигена, или принимает участие в защите от протеолитического воздействия ферментов.

    Пространственная структура ЭПА-1НГ г ее связь с антигенной активностью

    Изучение вторичной и третичной структуры ЭПА-1НГ проводили методами кругового дихроизма (КД) и УФ-спектроскопии.

    ЭПА-1НГ представляет собой белок с коэффициентом молярной экстинкции 279 ~ 8300±150 моль"* см-1. Определение числа остатков ароматических аминокислот в молекуле ЭПА-1НГ, проведенное нами по методу второй производной УФ-спектра в растворе 6М гуанидингидрохлорида, дает 5 остатков триптофана и 2 остатка тирозина.

    В спектре КД нативного ЭПА-1НГ в области поглощения ароматических хромофоров наблюдается одна широкая положительная полоса с максимумом при 278 нм и плечом в области 282-284 нм и две отрицательные полосы при 282 и 305 нч. относящиеся- к переходам остатков тирозина и триптофана (рис. 4а). ~В области поглощения пептидных связей наблюдаются две отрицательные полосы с максимумами при 202 и 192 нм (рис.46) и слабая положительная полоса с максимумом при 230 нм, вероятно, обусловленная вкладом ароматических аминокислот. Наличие интенсивной отрицательной полосы в области 200-210 ' нм характерно для белков с преимущественным содержанием Р-структур.

    Исследование зависимости спектров ЭПА-1НГ от температуры (рис.4) показывает, что эллиптичность всех полос в ароматической области плавно уменьшается с повышением температуры раствора (рис. 4а,в). В интервале температур 40-50°С наблюдается конформационный переход в третичной структуре молекулы ЭПА-1НГ. При 60°С происходит полное нарушение натипной третичной структуры ЭПА-1НГ. Охлаждение раствора ЭПА-1НГ до 20°С приводит к частичному восстановлению эллиптичности полос при 240,276,292 и 305 нм. Через один час после охлаждония указанные полосы восстанавливают до 80% исходной эллиптичности.

    Как следует из спектров КД ЭПА-1НГ в пептидной области (рис. 46,г), увеличение температуры раствора ЭПА-1НГ до 70°С приводит также к конформационноР. перестройке вторичной структуры белка. Спустя один час после прогревания раствора полоса при 202 нм восстанавливает до 70Х, а полоса при 192 нм - до 60Х исходной эллиптичности. '

    Расчет по методу Лровинчера элементов вторичной структуры

    Рис.4. Спектры КД ЭПА-1НГ в 0,01М К^РО^, рН 7.2.'

    1 - 20 С; 2 - 70 С; 3 - 20 С через 1 ч<»с после 70 С. а - С 1,0 ыг/ыл, 1-1 см; б - С 0,28 мг/мл 1-1 ыи; в - изменении эллиптичности полосн 276 ни от теыпературы; г - кзметтние пллкптичности полоси 192 нм от температуры.

    ЭПА-1НГ в зависимости от температуры показывает, что конформационный переход (температура раствора выше 40°С) приводит к уменьшению содержания бета-структуры и бета-изгибов и к увеличению доли неупорядоченной структуры. Для предварительно инкуСировйнного при 70°С раствора ЭПА-1НГ содержание элементов вторичной структуры белка восстанавливается полностью через один час после охлаждения раствора до 20°С. С вычетом вклада ароматических хромофоров в пептидную часть спектра ЭПА-1НГ конформационный переход сопровождается увеличением содержания альфа-спирали. Таким образом, конформационный переход в молекуле ЭПА-1НГ под действием тепловой денатурации обратим. На это также указывает сравнение антигенной активности нативного ЭПА-1НГ и денатурированного после тепловой обработки.

    Сопоставление полученных результатов иммуноферментного анализа со спектральными данными показывает, что до конформационного перехода антигенная активность не изменяется. После конформационного перехода наблюдается ее уменьшение на 17Х . Антигенная активность восстанавливается полностью через два- часа после охлаждения раствора ЭПА-1НГ, нагретого до 70°с.

    Наряду с изучением влияния температуры на пространственную структуру ЭПА-1НГ , проведено исследование еэ зависимости от рН раствора. На рис. 5(а,б) приведены спектры КД растворов ЭПА-1НГ в процессе титрования их кислотами и щелочами. С понижением рН от 7.2 до 4.0 в ароматической области спектра КД ЭПА-1НГ не наблюдается заметных изменений. При значениях рН ниже 4.0 происходит плавное уменьшение эллиптичности положительной полосы при 270 нм. Спектра КД ЭПА-1НГ при рН 2.1 и при 45°С подобны. Полного разрушения нативной третичной структуры молекулы ЭПА-1НГ не происходит даже при рН меньше 2.0. Титрование раствора ЭПА-1НГ до рН 11.2 вызывает очень незначительное изменение КД-спектра в ароматической области. Дальнейшее увеличение значения рН до 13.0, при котором происходит полная ионизация остатков тирозина, ^вызывает исчезновение наблюдаемых полос и появление интенсивной широкой положительной полосы при 252 нм.

    Просмотров: 189 | Добавил: husaddlyes | Рейтинг: 0.0/0
    Всего комментариев: 0
    Copyright MyCorp © 2025Конструктор сайтовuCoz